荧光实时定量PCR（qPCR）是一种精密的分子生物学技术，它通过在PCR反应体系中嵌入荧光探针或染料，实时监测DNA扩增过程，通过荧光信号的积累，准确评估目标基因的表达水平。qPCR技术的基石分为两种方法：SYBR Green荧光染料法和TaqMan荧光探针法。
实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对模板进行定量分析的方法。
检测方法SYBRGreenⅠ法：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
在实际操作中，荧光定量PCR的扩增片段控制范围非常重要，通常建议在80-300bp之间，以避免引物二聚体和扩增效率问题。引物设计是关键环节，理想的引物长度为20-24bp，确保其Tm值在60℃左右，以保证高效和特异性。荧光染料法和探针法是qPCR的两种常用方法。
PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。·Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。
1、打开荧光数据文件，选择需要计算积分荧光强度的荧光曲线。确定一个时间范围，通常是整个荧光曲线的时间范围。在荧光曲线上，选择一个荧光强度基线（baseline），通常选择曲线的最低点或者最初的几个时间点的平均值。
2、发射波长来获得。纵坐标就是相对荧光强度值（荧光强度都是相对值，每个仪器扫出的荧光强度可能都会不一样），横坐标是波长，如果是固定激发，横坐标就是发射波长，如果是固定了发射波长横坐标就是激发波长。
3、首先打开origin 将要区域积分的数据复制进工作表中。
4、我这数据是找朋友测得，然后没有在原来的机器上求出积分面积。现在想手动求一下面积。看了一些资料：有两种求法， 1。excel origin 具体怎么操作呢。
5、为了计算方便，设激发源、样品和探测器的相对位置如图10-2-2所示，假定激发源为单能光子源，入射X射线是平行的射线束，测量的二次X射线也是平行射束；样品（或岩石表面）是均匀的，具有无限大表面积，是平坦的。
1、qPCR数据处理方法为△△Ct法原理 【△△Ct法原理】其特点是只依靠Ct值来计算结果，因此跑完qPCR之后的结果中除了Ct值外，其他数据几乎在后续分析和计算中是用不到的。但前提是目的基因和内参基因的扩增效率应基本一致。
2、qPCR作为一种DNA定量手段，一般情况下， 还可以分为 绝对定量 和 相对定量 。好的， 那么一般情况下， 我见过比较多的qPCR，都是以RNA相对定量为目的的，也是本文讨论的焦点。qPCR和PCR一看名字就知道很像， q 就是quantitative的意思，quantitative就是定量的意思。。
3、今天我们讲讲假设检验这个东西，并且会以 qPCR数据处理 为例子，应用假设检验，获得传说中小于0.05就很了不起就P值。
4、首先建议生物学重复和技术重复保证三个左右，如果样本只有两个donor，可以将两者混匀后作为第三个样本。三个技术重复可以更加确保你数据的准确性。－△△CT方法中参照因子的选择决定于基因表达定量实验的类型。最简单的设计就是把未经处理的样品作为参照因子（calibrator ）。
5、上面显示p value summary为三颗星，即代表该数据具有统计学意义，并且为三颗星。第七步：返回属性图数据。即点击左边的Graphs下面的Data 1，点击最上面的Draw下面横线，选择横线，点击Write下面的黑体字T，在横线上面标记星号或者ns即可。该例子里的统计学分析为3颗星。完美的QPCR数据分析图就做出来啦。
6、我们发现，校正分析和无监督算法（如Kohonen self-organizing maps）对定义亚群和基因网络很有用。Finn-Arne Weltzien（挪威兽医学院）我们在利用单细胞qPCR进行定量测定时很小心。我们通常只进行定性分析。如果我们定量，我们会利用目的基因的拷贝数相对参考基因的拷贝数。
